Введение
Гибернация земноводных является одной из форм биологического покоя, позволяющих сохранять жизнеспособность в условиях понижения температуры окружающей среды. Среди лягушек есть виды с разной криорезистентностью (Берман и др., 2016). Лягушки рода Rana, такие как травяная, сибирская и дальневосточная (Rana temporaria L., 1758; Rana amurensis Boulenger, 1886; Rana dybowskii Gunther, 1876), зимуют как в воде, так и на суше, однако при переохлаждении способны переносить только малые отрицательные температуры (Берман и др., 2017).
Несмотря на значительные успехи в изучении механизмов адаптации клеток к температурным изменениям, многие аспекты остаются недостаточно исследованными, особенно в контексте эритроцитов земноводных. Холоднокровные животные подвергаются значительным колебаниям температуры в зависимости от условий окружающей среды, что оказывает влияние на их функциональные характеристики и метаболизм. Известно, что у рыб эритроциты за счет кислородтранспортной и адаптивно-компенсаторной функций участвуют в поддержании гомеостаза организма при изменении условий среды (Чернявских и др., 2018). У рептилий отмечают разницу в форме и величине эритроцитов в зависимости от видовой принадлежности (Четанов, Четанова, 2021). Однако до сих пор остаются малоизученными молекулярные и биохимические механизмы, посредством которых у лягушек эритроциты адаптируются к этим изменениям.
В связи с этим вопрос о физиологических изменениях в организме лягушек при снижении функциональной активности является актуальным, поскольку его изучение позволит получить дополнительные сведения об особенностях гипобиоза пойкилотермных животных и о влиянии абиотического стресса на клеточные структуры и их функции.
Цель работы: изучить изменение морфометрических параметров эритроцитов при гибернации и при дополнительном холодовом воздействии.
Материалы
Все исследованные особи были самцами и отловлены в местах естественного обитания. Материал для исследования, включающий кровь от 24 особей травяной лягушки (R. temporaria), был собран в период с октября 2023 по февраль 2024 г. – период естественной гибернации вида в природе. Животные на протяжении нескольких месяцев содержались при температуре 10–12 °С без освещения и пищи в аквариальной комнате вивария.
Методы
После отлова проводили предварительную недельную акклимацию животных к условиям аквариальной комнаты. Для оценки изменения показателей эритроцитов в условиях гибернации и после холодового воздействия животных на 1, 33, 48 и 99-е сутки экспозиции отбирали по три особи для контрольного и опытного вариантов. Контрольные особи оставались в исходных условиях в течение семи суток, тогда как опытные подвергались холодовому воздействию при температуре 4 °C. Пониженные температуры моделировались с помощью климатической камеры TH-ME-25 (Jeio Tech Lab Companion), обеспечивающей постоянство температуры и влажности на протяжении семи суток эксперимента.
Рис. 1. Схема эксперимента
Fig. 1. The scheme of the experiment
Кровь отбирали после пункции сердца в пробирку, обработанную антикоагулянтом ЭДТА (ООО «МиниМед»). Мазки крови, окрашенные по Романовскому – Гимзе, просматривали и фотографировали на микроскопе «МИКМЕД-6» с камерой МС-5 (USB-2.0) при увеличении (окуляр 10, объектив 40) (АО «ЛОМО», Россия). На каждом препарате измеряли длину и ширину для 100 клеток. Анализ микрофотографий и измерение линейных размеров эритроцитов и их ядер проводили в программе JMicroVision 1.3.4 (Roduit, 2019). Всего было обработано 75 микрофотографий мазков крови и измерены показатели у 2400 клеток по 100 для каждой особи, включенной в эксперимент.
Расчет морфометрических параметров эритроцитов проводили на основе измерения продольной и поперечной осей эритроцита (C1 и C2 соответственно) и ядра (N1 и N2 соответственно). Используя полученные линейные размеры проводили расчет ряда характеристик эритроцитов: показатель формы клеток (MS), объем клетки (Vc), объем ядра (Vn), площадь поверхности клетки (Sc), ядерно-цитоплазматическое отношение (NCR), удельную поверхность эритроцитов (SSc) (Кухарева, Солдатов, 2016). Согласно коэффициенту эксцентричности (ɛ) выделяли три класса эритроцитарных субпопуляций: eliptocytus (нормальные эллипсоидные клетки) – коэффициент эксцентричности (ε) – 0.7-0.75; magnulocytus (широкоэллиптические клетки) – ε ≥ 0.76; teretiocytus (округлые клетки) – ε ≤ 0.69 (Скоркина, Зеленцова, 2004).
Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием программ MS Office Excel, STATISTICA 10 (StatSoft Inc., США). Нормальность распределения оценивали с помощью метода Шапиро – Уилка. Для подтверждения достоверности различий между двумя выборками использовали либо U-критерий Манна – Уитни, когда наблюдалась ненормальность распределения, либо t-критерий Стьюдента при нормальном распределении. Для оценки качественных признаков использовали критерий соответствия χ2 Пирсона. Уровень значимости для всех видов сравнения принимался 0.05 (p ≤ 0.05).
Использование и уход за экспериментальными животными соответствовал законам Российской Федерации по защите животных, а также руководящим принципам ARRIVAL и Директиве ЕС 2010/63/ЕС для экспериментов на животных.
Результаты
Первые отборы проб крови проводились у особей, отобранных из естественной среды в октябре и прошедших недельную акклимацию к искусственно созданным условиям содержания (отсутствие освещения и питания, температура воздуха 14…15 °С). Далее на протяжении 106 суток лягушки содержались в условиях аквариальной комнаты (температура 10…12 °С, без света и пищи). Данные, полученные в октябре (начальный контроль) при первом снятии результатов, принимали в качестве исходных, как наиболее приближенные к естественным условиям среды, так как в этот период лягушки еще находились в относительно активном состоянии. Полученные исходные размерные параметры эритроцитов, такие как длина эритроцита по продольной (C1: 21.72 ± 0.10 мкм) и поперечной оси клетки (C2 16.32 ± 0.07 мкм) и ядра (N1 11.01 ± 0.08 мкм, N2 6.64 ± 0.07 мкм), позволили рассчитать основные характеристики эритроцитов: показатель формы клетки 1.33 ± 0.01; объем ядра 263.06 ± 7.27 мкм3, объем клетки 1058.77 ± 11.79 мкм3, площадь поверхности клетки 1233.05 ± 12.22 мкм2, ядерно-цитоплазматическое отношение 0.24 ± 0.01, удельная поверхность эритроцитов 1.17 ± 0.01 мкм2/мкм3. В эритроцитарной субпопуляции, согласно коэффициенту эксцентричности, преобладали округлые клетки (75.3 %) и нормальные эллипсоидные клетки (18.7 %), при этом количество широкоэллиптических клеток (6 %) было минимально.
По мере увеличения длительности содержания лягушек в аквариальной комнате для каждой серии экспериментов отбирали дополнительный контроль, поскольку в таких условиях животные постепенно переходили в состояние пониженной функциональной активности. Так, на 2-м этапе, после месячного периода гибернации, выявлены изменения в морфометрических показателях эритроцитов: C1 25.45 ± 0.2мкм, C2 19.67 ± 0.20 мкм, длина ядра по продольной оси N1 11.40 ± 0.13 мкм, по поперечной оси N2 7.22 ± 0.11 мкм. Изменились и основные параметры эритроцитов: показатель формы клетки 1.30 ± 0.10, объем ядра 337.80 ± 5.27 мкм3, объем клетки 1619.61 ± 42.43 мкм3, площадь поверхности клетки 1696.67 ± 50.93 мкм2, ядерно-цитоплазматическое отношение 0.200 ± 0.004, удельная поверхность эритроцитов 1.22 ± 0.01 мкм2/мкм3 (табл. 1). При этом в эритроцитарной субпопуляции отмечено увеличение доли округлых клеток до 81.2 % за счет уменьшения количества нормальных эллипсоидных (12.0 %) и широкоэллиптических клеток (6.8 %).
Холодовая 7-суточная экспозиция лягушек при температуре воздуха 4 °С в климатической камере в этот же период повлияла на морфометрические показатели эритроцитов (см. табл. 1).
Таблица 1. Морфометрические показатели эритроцитов периферической крови лягушки R. temporaria при воздействии пониженных температур (2-й этап)
| Показатели эритроцитов | Контроль | Опыт |
| MS | 1.30 ± 0.10* | 1.26 ± 0.01** |
| Vn, мкм3 | 337.84 ± 5.27* | 165.53 ± 5.27** |
| Vc, мкм3 | 1619.61 ± 42.43* | 1002.50 ± 13.01** |
| Sc, мкм2 | 1696.67 ± 50.93* | 1233.05 ± 12.22** |
| NCR | 0.200 ± 0.004* | 0.160 ± 0.004** |
| SSc, мкм2/мкм3 | 1.22 ± 0.01* | 1.29 ± 0.01** |
| C1, мкм | 25.45 ± 0.25* | 21.77 ± 0.12** |
| C2, мкм | 19.67 ± 0.20* | 14.64 ± 0.1** |
| N1, мкм | 11.40 ± 0.13* | 9.55 ± 0.09** |
| N2, мкм | 7.22 ± 0.11* | 5.60 ± 0.07** |
Примечание. * – достоверные различия между контролем на 1-м и 2-м этапах отбора особей, ** – достоверные различия между контролем 2-го этапа и опытной группой (U-критерий Манна – Уитни, р ≤ 0.05).
У особей, экспонировавшихся к пониженной температуре, отмечено уменьшение линейных размеров клетки на конец экспозиции: длина эритроцитов по продольной оси уменьшается на 19 %, поперечной – на 28.9 %, длина ядра по продольной оси уменьшается на 15.7 %, по поперечной оси – на 34.3 %. Вследствие этого изменяются и морфофункциональные параметры эритроцитов: уменьшаются на 3 % показатель формы клетки, объем клетки на 38 %, объем ядра на 51 %, площадь поверхности клетки на 27.3 %, ядерно-цитоплазматическое отношение на 20 %. При этом отмечается увеличение удельной поверхности эритроцитов на 5.7 %. В эритроцитарной субпопуляции незначительно возрастает доля округлых клеток (89.2 %) за счет уменьшения количества нормальных эллипсоидных (7.7 %) и широкоэллиптических клеток (3.1 %).
Через полтора месяца содержания лягушек в контрольных условиях (3-й этап) отмечаются некоторые изменения в морфометрических показателях эритроцитов по отношению к первой съемке данных в исходной контрольной группе (табл. 2).
Таблица 2. Морфометрические показатели эритроцитов периферической крови лягушки R. temporaria при воздействии пониженных температур (3-й этап)
| Показатели эритроцитов | Контроль | Опыт |
| MS | 1.48 ± 0.01* | 1.54 ± 0.01** |
| Vn, мкм3 | 265.45 ± 12.28* | 185.71 ± 4.52** |
| Vc, мкм3 | 1025.90 ± 13.58* | 947.48 ± 12.59** |
| Sc, мкм2 | 1179.05 ± 12.59 | 1180.94 ± 15.18 |
| NCR | 0.230 ± 0.008* | 0.190 ± 0.003** |
| SSс, мкм2/мкм3 | 1.180 ± 0.013* | 1.250 ± 0.004** |
| C1, мкм | 22.03 ± 0.11 | 22.23 ± 0.11 |
| C2, мкм | 14.94 ± 0.06* | 14.64 ± 0.10** |
| N1, мкм | 10.65 ± 0.14* | 10.04 ± 0.07** |
| N2, мкм | 6.25 ± 0.10* | 5.81 ± 0.05** |
Примечание. * – достоверные различия между контролем на 1-м и 3-м этапах отбора особей, ** – достоверные различия между контролем 3-го этапа и опытной группой (U-критерий Манна – Уитни, р ≤ 0.05).
Длина эритроцита по продольной составила 22.03 ± 0.11 мкм, по поперечной оси клетки 14.94 ± 0.20 мкм; длина ядра по продольной оси 10.65 ± 0.14 мкм, по поперечной оси 6.25 ± 0.10 мкм. Изменились и основные параметры эритроцитов: показатель формы клетки 1.48 ± 0.01; объем ядра 265.45 ± 12.28 мкм3, объем клетки 1025.9 ± 13.58 мкм3, площадь поверхности клетки 1179.05 ± 12.59 мкм2, ядерно-цитоплазматическое отношение 0.230 ± 0.008, удельная поверхность эритроцитов 1.18 ± 0.013 мкм2/мкм3. При этом в эритроцитарной субпопуляции доля округлых клеток уменьшается до 28.1 % за счет увеличения количества нормальных эллипсоидных (37.3 %) и широкоэллиптических клеток (34.6 %).
После 7-суточной экспозиции при температуре 4 °С в этот период (3-й этап) выявлено статистически значимое снижение длины эритроцита как по продольной (на 6 %), так и поперечной оси (на 7 %), уменьшение длины ядра по поперечной оси (на 3 %) (см. табл. 2). Отмечено статистически значимое увеличение показателя формы клетки на 4 %, уменьшение объема клетки и объема ядра на 30 % и 7.7 % соответственно, ядерно-цитоплазматического отношения на 17.4 %. При этом наблюдается увеличение удельной поверхности эритроцита на 6 %. В эритроцитарной субпопуляции практически не меняется доля округлых клеток (27.8 %), увеличивается доля широкоэллиптических клеток (44.8 %) и снижается доля нормальных эллипсоидных эритроцитов (27.8 %).
После 3-месячной гибернации производили третий отбор крови для анализа морфометрических показателей эритроцитов (4-й этап). Обнаружено, что по отношению к данным исходной контрольной группы также произошли изменения в показателях эритроцитов (табл. 3). Длина эритроцита по продольной оси клетки составила 9.62 ± 0.05 мкм, по перечной 5.01 ± 0.02 мкм; длина ядра по продольной оси 22.74 ± 0.08 мкм, по поперечной оси 13.66 ± 0.07 мкм. Изменились и основные параметры эритроцитов: показатель формы клетки 1.67 ± 0.01; объем ядра 129.02 ± 2.18 мкм3, объем клетки 1076.07 ± 9.23 мкм3, площадь поверхности клетки 1424.20 ± 12.19 мкм2, ядерно-цитоплазматическое отношение 0.170 ± 0.003, удельная поверхность эритроцитов 1.270 ± 0.004 мкм2/мкм3. При этом в эритроцитарной субпопуляции максимально увеличивается доля широкоэллиптических клеток (82.4 %), снижена доля нормальных эллипсоидных эритроцитов (14.1 %) и минимальна доля округлых клеток (3.5 %).
Таблица 3. Морфометрические показатели эритроцитов периферической крови лягушки R. temporaria при воздействии пониженных температур (4-й этап)
| Показатели эритроцитов | Контроль | Опыт |
| MS | 1.67 ± 0.01* | 1.45 ± 0.01** |
| Vn, мкм3 | 129.02 ± 2.18* | 154.28 ± 2.87** |
| Vc, мкм3 | 876.28 ± 6.75* | 1076.07 ± 9.23** |
| Sc, мкм2 | 1158.71 ± 9.43* | 1424.20 ± 12.19** |
| NCR | 0.140 ± 0.002 | 0.140 ± 0.002 |
| SSc, мкм2/мкм3 | 1.320 ± 0.003 | 1.320 ± 0.003 |
| C1, мкм | 22.74 ± 0.08* | 23.58 ± 0.09** |
| C2, мкм | 13.66 ± 0.07* | 16.36 ± 0.08** |
| N1, мкм | 9.62 ± 0.05* | 10.18 ± 0.06** |
| N2, мкм | 5.01 ± 0.02* | 5.31 ± 0.04** |
Примечание: * – достоверные различия между контролем на 1-м и 4-м этапах отбора особей, ** – достоверные различия между контролем 4-го этапа и опытной группой (U-критерий Манна – Уитни, р ≤ 0.05).
Экспозиция особей в течение 7 суток при температуре 4 °С в это время приводит к увеличению длины эритроцита по продольной оси на 5.8 %, по поперечной на 6 %, длина ядра по продольной оси на 3.6 %, по поперечной на 16.5 % (р ≤ 0.05). По функциональным показателям отмечено уменьшение показателя формы клетки на 13.2 %, увеличение объема ядра на 19.6 %, объема клетки на 22.7 %, площади поверхности клетки на 22.9 %. Что касается изменения соотношения эритроцитарных популяций, то после холодовой экспозиции отмечается уменьшение доли широкоэллиптических клеток (26.7 %) за счет возрастания долей нормальных эллипсоидных (31.6 %) и округлых клеток (41.7 %).
Полученные данные показали, что на протяжении эксперимента с 1-х по 106-е сутки экспозиции в контрольной группе лягушек происходили изменения показателей эритроцитов. Поэтому дополнительно был проведен анализ изменения функциональных показателей эритроцитов у особей контрольных групп, содержащихся в аквариальной комнате в условиях отсутствия освещения, питания и при температуре 10...12 ºС. Результаты показали, что по мере увеличения периода нахождения лягушек в данных условиях изучаемые показатели эритроцитов изменяются (табл. 4).
Таблица 4. Морфометрические показатели эритроцитов периферической крови лягушек R. temporaria контрольных групп за период экспозиции
| Показатели эритроцитов | Период экспозиции, сутки | |||
| 1-й этап | 2-й этап | 3-й этап | 4-й этап | |
| MS | 1.33 ± 0.01a | 1.3 ± 0.10a | 1.48 ± 0.01b | 1.67 ± 0.01c |
| Vn, мкм3 | 263.06 ± 7.27a | 337.8 ± 5.27b | 265.4 ± 12.28a | 129.02 ± 2.18с |
| Vc, мкм3 | 1058.77 ± 11.79a | 1619.61 ± 42.43b | 1025.90 ± 13.58a | 876.28 ± 6.75с |
| Sc, мкм2 | 1233.05 ± 12.22a | 1696.67 ± 50.93b | 1179.05 ± 12.59af | 1158.71 ± 9.43df |
| NCR | 0.24 ± 0.01a | 0.20 ± 0.004b | 0.23 ± 0.008a | 0.14 ± 0.002c |
| SSc, мкм2/мкм3 | 1.17 ± 0.01a | 1.22 ± 0.01b | 1.18 ± 0.013c | 1.32 ± 0.003d |
| C1, мкм | 21.72 ± 0.10ab | 25.45 ± 0.25a | 22.03 ± 0.11b | 22.74 ± 0.08c |
| C2, мкм | 16.32 ± 0.07a | 19.67 ± 0.20b | 14.94 ± 0.06a | 13.66 ± 0,.07c |
| N1, мкм | 11.01 ± 0.08a | 11.40 ± 0.13b | 10.65 ± 0.14a | 9.62 ± 0.05c |
| N2, мкм | 6.64 ± 0.07a | 7.22 ± 0.11b | 6.25 ± 0.10c | 5.01 ± 0.02d |
Примечание. Различные надстрочные символы в каждой строке указывают на статистически значимые различия между этапами эксперимента (U-критерий Манна – Уитни, р ≤ 0.05).
Отмечается динамика изменения показателей эритроцитов от статистически значимого увеличения объема клетки, ядра, площади поверхности клетки, удельной поверхности эритроцитов до фактического возвращения к прежним значениям показателей через полтора месяца и повторного изменения к концу экспозиции.
Так, значение показателя формы клетки эритроцитов постепенно увеличивается на 3-м этапе на 11 % (р ≤ 0.05), а к концу общей экспозиции имеет наиболее высокий показатель (увеличился на 21 %, р ≤ 0.05), что свидетельствует о том, что в кровотоке увеличилось количество эритроцитарных форм более вытянутой эллипсоидной формы. Продольная ось (С1) клетки увеличилась по сравнению с первыми сутками на 4.7 % (р ≤ 0.05), а поперечная уменьшилась на 16.2 % (р ≤ 0.05). Эта динамика подтверждается и по расчетам коэффициента эксцентричности – ростом к концу экспозиции доли субпопуляции широкоэллиптических клеток (р ≤ 0.05).
Значения объема клетки и объема ядра, увеличиваясь (на 53 % и 28 % соответственно, р ≤ 0.05) на 2-м этапе, к 3-му этапу возвращаются к контрольным данным, а к 4-му становятся значительно меньше (на 17.3 % и 49 % соответственно, р ≤ 0.05) начальных данных. По отношению к ядерно-цитоплазматическому соотношению прослеживается аналогичная динамика, только здесь через месяц отмечается уменьшение данного показателя (на 16.7 %), обусловленное ростом объема клетки, затем его возвращение к первоначальным данным на 3-м этапе и вновь снижение на конец экспозиции (на 35 %), связанное с большим уменьшением объема ядра в сравнении с клеткой.
При оценке респираторных характеристик эритроцитов (диффузная площадь поверхности и удельная поверхность клетки) прослеживается аналогичная динамика: на 2-м этапе отмечается рост респираторных характеристик клетки (Sc на 37.6 %, SSc на 4.2 %, р ≤ 0.05), затем снижение на 3-м (на 31 %, р ≤ 0.05) и дальнейшее понижение значения площади поверхности клетки с одновременным ростом удельной поверхности к 4-му этапу. Показатель удельной поверхности эритроцитов при этом увеличивается на 8.8 %, что, вероятно, связано с относительной стабилизацией функциональности и адаптацией клеток при гипобиозе.
Все отмеченные показатели по мере увеличения длительности экспозиции статистически значимо отличаются от первоначальных контрольных данных в зависимости от длительности экспозиции, что свидетельствует о происходящих изменениях в морфологии и функциональности эритроцитов в ответ на переход в состояние гипобиоза (см. табл. 4).
Аналогичная динамика прослеживается и по соотношению субпопуляций эритроцитов, выделяемых согласно коэффициенту эксцентричности. При первом снятии данных в исходной контрольной группе преобладает субпопуляция округлых клеток эритроцитов, при этом популяция широкоэллиптических клеток минимальна (табл. 5).
Таблица 5. Соотношение субпопуляций эритроцитов по коэффициенту эксцентричности за период экспозиции у лягушек R. temporaria
| Тип субпопуляции эритроцитов | 1-й этап | 2-й этап | 3-й этап | 4-й этап |
| Нормальные эллипсоидные клетки | 18.7а | 12.0а | 37.3b | 14.1cf |
| Широкоэллиптические клетки | 6.0а | 6.8а | 34.6b | 82.4cf |
| Округлые клетки | 75.3а | 81.2а | 28.1b | 3.5cf |
Примечание. Различные надстрочные символы в каждой строке указывают на статистически значимые различия между этапами эксперимента (критерий соответствия χ2 Пирсона, р ≤ 0.05).
По мере увеличения периода экспозиции наблюдаются изменения в соотношении разных субпопуляций эритроцитов в крови лягушек. Через месяц экспозиции статистически значимых изменений не выявлено, по-прежнему преобладают округлые клетки. К 3-му этапу выявлено статистически значимое изменение в соотношении эритроцитарных субпопуляций – все три группы имеют практически равные доли. Однако к концу экспозиции контрольной группы лягушек доля широкоэллиптических эритроцитов статистически значимо увеличивается, а доля округлых клеток снижается (р < 0.001).
Обсуждение
Одним из функциональных показателей, отражающих состояние организма, является изменение морфологических характеристик клеток эритроцитов, определяющих их респираторные свойства. Информация об изменениях этих параметров при снижении уровня биологической и физиологической активности, а также при переходе представителей земноводных в состояние биологического покоя представляет значительный интерес. Размер эритроцита является видоспецифической, стабильной характеристикой, которая сформировалась в ходе эволюции. Эритроцитарные клетки обладают способностью к изменению формы и размеров, что обеспечивает им возможность свободно проходить через микроциркуляторное русло (Липунова, Скоркина, 2004). Известно, что у земноводных эритроциты весьма чувствительны к воздействию неблагоприятных факторов среды (Минеева, Минеев, 2010). В связи с тем что более мелкие эритроциты характерны для животных с более высоким уровнем метаболизма, вероятно, их размеры могут выступать в качестве важного показателя адаптивной способности к концентрированию энергетических ресурсов (Липунова, Скоркина, 2004; Четанов, Четанова, 2021). Эритроциты млекопитающих разных видов различаются по размеру и форме. Увеличение их размера позволяет достичь более высокой концентрации Hb и повысить способность крови переносить кислород. При этом размер эритроцитов взаимосвязан и с экологическими факторами обитания, такими как условия среды обитания, двигательная активность и др. (Kizhina et al., 2020; Трошкина и др., 2007).
Для взрослых лягушек R. temporaria, по данным литературы, нормальными условиями и предпочитаемыми температурами на суше являются 17…20 °С. Для них сезон активности определяется по числу дней в году при среднесуточной температуре выше +5 °С (Ляпков, 2012). В естественных условиях в осенний период лягушки постепенно готовятся к переходу в состояние гибернации, характеризующееся пониженной реактивностью организма, снижением активности процессов ассимиляции и диссимиляции, ограничением и ослаблением функционирования жизнеспособных структур клеток (Голдовский, 1977). Травяная лягушка относительно устойчива к переохлаждению, а при температурах около 0 °С переходит в состояние гибернации, принимая характерную «зимовочную» позу (Берман и др., 2017).
В целях детального изучения влияния снижения функциональной активности на эритроциты был проведен анализ изменений их морфометрических показателей в ходе гибернации. Анализ показал наличие динамики изменения изучаемых показателей эритроцитов, отражающих изменение функционального состояния особей в условиях температуры 10…12 °С, при отсутствии пищи и освещения, связанное с перестройкой физиологических процессов. Длительная гибернация приводила к постепенному подавлению функциональной активности животных, что отражалось в показателях эритроцитов. Выявленное после 1 месяца значительное увеличение объема клетки и ядра (53 % и 28 %), площади поверхности клетки и удельной поверхности эритроцитов (37.6 % и 4.2 %) при одновременном уменьшении ядерно-цитоплазматического соотношения свидетельствует о том, что в клетках идет повышение обменных процессов в этот период. Через полтора месяца экспозиции отмечено постепенное возвращение практически всех показателей к исходным данным (кроме показателя формы клетки, он увеличивается, т.е. клетка становится более вытянутой по продольной оси формы). Данная тенденция уменьшения значений показателей наблюдается и к концу экспозиции на 4-м этапе, при этом отмечено увеличение удельной поверхности эритроцита. Причем в это время наиболее значительно уменьшается объем ядра, что свидетельствует о значительном снижении обменных процессов.
Возможно, полученные результаты связаны с разными функциональными особенностями. Исследования на самцах R. ridibunda показали, что в состоянии гибернации количество эритроцитов значительно ниже в сравнении с периодом весенне-летней активности, однако в некоторых случаях показана активация эритропоэза, приводящая к увеличению количества эритроцитов и уменьшению их объема (Липунова, Скоркина, 2004). С другой стороны, при переходе лягушек в более глубокую фазу биологического покоя уменьшение объема клетки и ядра может быть обусловлено снижением метаболизма, уменьшением количества свободной воды (Голдовский, 1977; Иванов, 2008; Жмакин, 2008), а соответственно, постепенной дегидратацией эритроцитов.
Также отмечено, что по мере увеличения продолжительности экспозиции в крови контрольной группы лягушек наблюдаются изменения в соотношении эритроцитарных популяций. Статистически значимые изменения отмечены через полтора месяца гибернации, выражающиеся в постепенном увеличении и максимальном преобладании к концу экспозиции доли широкоэллиптических клеток. Трансформация формы эритроцита может быть связана с изменением проницаемости и текучести плазматической мембраны, что приводит к частичной дегидратации клетки. Стабильность и деформируемость мембран эритроцитов зависит от жестокости белковой сети цитоскелета и вязкостно-эластических свойств мембранных липидов. При этом деформируемость клетки снижается с увеличением вязкости внутриклеточного содержимого (Липунова, Скоркина, 2004).
Важно отметить, что за общий период экспозиции контрольной группы отмечается динамика практически всех показателей, что, вероятнее всего, связано с их скоррелированным изменением. Можно прийти к заключению, что сходная динамика изменения морфофункциональных показателей – снижение объемов ядра и клетки, уменьшение ЯЦО и площади поверхности клетки – свидетельствует о снижении активности обменных процессов эритроцитов в целом, что и отражает переход организма в состояние биологического покоя.
Считается, что температура 4 °С – это верхняя граница холодового воздействия, однако она не является критичной для выживания лягушек. Известно, что они остаются относительно активными и при более низких значениях температуры 3...5 °С (Берман и др., 2017). С другой стороны, результаты экспериментов показывают, что семисуточная экспозиция лягушек при данной температуре приводит к значительным изменениям морфометрических показателей эритроцитов и зависит от общей функциональной активности животного.
Так, после холодового воздействия (+4 °С) у лягушек, находившихся в состоянии гибернации в течение одного месяца, выявлено уменьшение объема клетки и ядра, ядерно-цитоплазматического отношения, площади поверхности клетки при одновременном увеличении удельной поверхности эритроцитов, что свидетельствует о преобладании в кровяном русле эритроцитов более округлой формы и меньших размеров. Выявленные изменения свидетельствуют о снижении уровня обменных процессов в эритроцитах, их респираторных характеристик и проявлении компенсаторных реакций. Стоит отметить, что холодовое воздействие после месячной гибернации приводит к наибольшим изменениям в морфрометрических показателях эритроцитов по сравнению с результатами дальнейших опытов. Вероятно, выявленные изменения связаны именно с компенсационными изменениями на уровне клеточных элементов, а не изменениями процессов эритропоэза. Это подтверждается и данными контрольной группы, согласно которым обменные процессы эритроцитов в этот период возрастали по сравнению с первыми сутками экспозиции.
При холодовом воздействии через полтора месяца гибернации выявлено, что размеры клетки и ядра по сравнению с контрольной группой также уменьшаются, но уже не так активно (30 % и 7.6 % соответственно). Одновременно отмечается уменьшение значения ядерно-цитоплазматического отношения, а площадь поверхности клетки не изменяется при увеличении ее удельной поверхности. Подобное изменение показателей свидетельствует о снижении реактивности организма при отсутствии глубокой гибернации.
Однако через три месяца гибернации холодовое воздействие приводит к иному эффекту: увеличению размеров эритроцитов за счет увеличения объемов ядра, клетки и площади ее поверхности. При этом значения ядерно-цитоплазматического отношения и удельной поверхности клетки не изменяются. Подобные изменения, например увеличение объема эритроцита, отмечаются и у эритроцитов Carassius gibelio при инкубации крови при температуре +5 °С (Чернявских, 2018).
Полученные нами результаты, свидетельствующие об изменениях морфометрических параметров эритроцитов, подтверждают имеющиеся в литературе данные о том, что параметры красных клеток изменяются как при пониженной, так и при повышенной температуре (Чернявских, 2018). В связи с этим можно предположить, что в условиях семисуточного холодового воздействия происходящее увеличение размеров эритроцитов является приспособительной реакцией для сохранения объема обменных процессов. Согласно литературным данным, при пониженной температуре инкубации у эритроцитов отмечается снижение упругости и адгезии клеток (Чернявских, 2018). Косвенно это может свидетельствовать о работе адаптивных механизмов, связанных с уменьшением функциональной активности клеток в условиях гипотермии. Так, диффузионная поверхность эритроцитов после месячной гибернации и холодовой нагрузки снижается, на 2-м этапе (полтора месяца гибернации) не отличается от контрольных значений, а через три месяца экспозиции аналогичное воздействие приводит к ее повышению. Это свидетельствует о зависимости ответной реакции организма на холодовое воздействие, в частности респираторных характеристик эритроцита, от состояния организма.
Анализ влияния холодового воздействия (4 °С) в течение 7 суток на соотношение эритроцитарных субпопуляций показал, что статистически значимые отличия от контрольной группы отмечены только на последнем этапе общей экспозиции. Выявлено значительное снижение доли широкоэллиптических клеток и рост доли округлых клеток. Возможно, это связано именно с воздействием данной температуры и является одним из адаптационных механизмов к гипотермическому стрессу.
Заключение
Полученные результаты исследования эритроцитов лягушки R. temporaria демонстрируют значительные изменения в морфофункциональных показателях клеток при понижении физиологической активности организма и в ответ на холодовое воздействие. При этом выраженность ответного эффекта зависит от длительности гибернации, а соответственно, и функционального состояния организма. Подтверждена высокая вариабельность форм эритроцитов у лягушек и наличие зависимости соотношений эритроцитарных субпопуляций от физиологического состояния особи.
Библиография
Берман Д. И., Мещерякова Е. Н., Булахова Н. А. Экстремальные отрицательные температуры и потери массы сибирским углозубом (Salamandrella keyserlingii, Amphibia, Hynobiidae) // Доклады академии наук. 2016. Т. 468, № 5. С. 589–593.
Берман Д. И., Булахова Н. А., Мещерякова Е. Н. Адаптивные стратегии бурых лягушек (Amphibia, Anura, Rana) в отношении зимних температур на севере Палеарктики // Зоологический журнал. 2017. Т. 96, № 11. С. 1392–1403.
Голдовский А. М. Основы учения о состояниях организмов . Л.: Наука, 1977. 116 с.
Жмакин А. И. Физические основы криобиологии // Успехи физических наук. 2008. Т. 178, № 3. С. 243–266.
Иванов К. П. Жизнь при минимальных расходах энергии // Успехи физиологических наук. 2008. Т. 39, № 1. С. 42–54.
Кухарева Т. А., Солдатов А. А. Функциональная морфология эритроидных элементов крови Neogobius melanostomus P. в процессе клеточной дифференцировки // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2016. Т. 52, № 3. С. 233–238.
Липунова Е. А., Скоркина М. Ю. Система красной крови: Сравнительная физиология: Монография . Белгород: Изд-во БелГУ, 2004. 216 с.
Ляпков С. М. Географическая изменчивость и половые различия по длине тела и возрастному составу у травяной лягушки: формирование и закономерности проявления // Принципы экологии. 2012. № 2. С. 22–44.
Минеева О. В., Минеев А. К. Нарушения морфологии эритроцитов периферической крови озёрной лягушки Rana ridibunda Pallas, 1771 // Вестник Нижегородского университета им. Н. И. Лобачевского. 2010. № 2 (2). С. 664–667.
Скоркина М. Ю., Зеленцова А. С. К методике оценки геометрических параметров эритроцитарной популяции у лягушек // Фундаментальные исследования. 2004. № 4. С. 100–101. URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=5487 (дата обращения: 12.04.2026).
Трошкина Н. А., Циркин В. И., Дворянский С. А. Эритроцит: строение и функции его мембраны // Вятский медицинский вестник. 2007. № 2 (3). С. 32–40.
Чернявских С. Д., До Х. К., Во В. Т. Влияние температуры на морфометрические и физические показатели эритроцитов и полиморфо-ядерных лейкоцитов (Carassius gibelio (Bloch) // Биология внутренних вод. 2018. № 1. С. 95–99.
Четанов Н. А., Четанова Т. Ю. Некоторые морфологические особенности эритроцитов двух видов змей Нижнего Поволжья // Вестник ПГГПУ. 2021. Серия № 2. Физико-математические и естественные науки. С. 68–73.
Kizhina A. G., Kalinina S. N., Uzenbaeva L. B., Panchenko D. V., Łapiński S., Ilyukha V. A., Pechorina E. F. & Fokina V. O. Comparative study of erythrocyte morphology and size in relation to ecophysiological adaptations in Rodentia species // Russian Journal of Theriology. 2020. Vol. 19 (2). P. 161–171.
Roduit N. JMicroVision: Image analysis toolbox for measuring and quantifying components of high-definition images. Version 1.3.1. URL: https://jmicrovision.github.io (дата обращения: 05.04.2019).
© 2011 - 2026